Natura volume 618, pagine 118–125 (2023) Citare questo articolo
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Il volo asincrono degli insetti è una delle forme più diffuse di locomozione animale utilizzata da oltre 600.000 specie. Nonostante le approfondite conoscenze sui modelli motori1, sulla biomeccanica2,3 e sull'aerodinamica alla base del volo asincrono4,5, l'architettura e la funzione della rete neurale di generazione del modello centrale (CPG) rimangono poco chiare. Qui, sulla base di un approccio teorico-esperimento che include elettrofisiologia, optofisiologia, genetica della Drosophila e modellizzazione matematica, identifichiamo una soluzione circuitale miniaturizzata con proprietà inaspettate. La rete CPG è costituita da motoneuroni interconnessi da sinapsi elettriche che, contrariamente alla dottrina, producono un'attività di rete distribuita nel tempo invece che sincronizzata tra i neuroni. Prove sperimentali e matematiche supportano un meccanismo generico per la desincronizzazione della rete che si basa su sinapsi elettriche deboli e dinamiche di eccitabilità specifiche dei neuroni accoppiati. Nelle piccole reti, le sinapsi elettriche possono sincronizzare o desincronizzare l'attività della rete, a seconda della dinamica intrinseca dei neuroni e della composizione dei canali ionici. Nel CPG di volo asincrono, questo meccanismo traduce l'input premotorio non modellato in scariche neuronali stereotipate con sequenze fisse di attivazione cellulare che assicurano una potenza stabile del battito delle ali e, come mostriamo, è conservato in più specie. I nostri risultati dimostrano una più ampia versatilità funzionale delle sinapsi elettriche nel controllo dinamico dei circuiti neurali ed evidenziano l’importanza del rilevamento delle sinapsi elettriche nella connettomica.
Con oltre un milione di specie conosciute, gli insetti costituiscono il gruppo più numeroso di animali sulla Terra6. Il loro notevole successo evolutivo è stato attribuito alle piccole dimensioni corporee e alla capacità di volare. Queste due caratteristiche forniscono l’accesso a nicchie inutilizzate e una rapida traslocazione, ma i vincoli aerodinamici nei piccoli volatori richiedono frequenze elevate del battito delle ali, e i vincoli spaziali richiedono la miniaturizzazione dei controllori nervosi centrali per il volo7. Nel 75% di tutte le specie di insetti volanti, i muscoli del volo altamente specializzati, indiretti e asincroni formano un sistema oscillatorio che genera frequenze di battito d'ali di 100-1.000 Hz mediante l'attivazione reciproca dell'allungamento dei muscoli delle ali antagonisti per garantire la propulsione in avanti a bassi numeri di Reynolds1,8. I motoneuroni del volo (MN) che innervano i muscoli del volo asincrono si attivano a frequenze molto più basse, quindi non attivano i muscoli su base ciclo per ciclo. Tuttavia, la potenza erogata è regolata da una rete CPG nel sistema nervoso centrale che controlla le frequenze di attivazione dei MN per regolare i livelli di calcio mioplasmico che, a loro volta, regolano la frequenza e l'ampiezza del battito delle ali1. Sebbene il volo asincrono sia emerso indipendentemente 7-10 volte durante l’evoluzione8, non sono stati identificati né i principi dell’architettura CPG per generare output MN dal sistema nervoso centrale miniaturizzato dei volatori asincroni né le relative conseguenze funzionali.
Per quantificare i modelli di volo asincroni e decifrare l'architettura CPG, abbiamo utilizzato l'emissione di fuoco dei cinque MN identificati (MN1–5) che innervano il muscolo depressore dell'ala longitudinale dorsale (DLM) del sistema modello genetico9,10,11 Drosophila melanogaster così come altri specie di insetti (per verificare la generalità). Il DLM fornisce la forza per la corsa verso il basso dell'ala, è costituito da sei fibre muscolari, ciascuna delle quali è innervata da uno dei cinque MN identificati9,10,11 (MN1–5; Fig. 1a). Ciascuno MN1-4 prende di mira una delle quattro fibre DLM più ventrali ipsilaterali al soma, mentre MN5 innerva le fibre DLM 5 e 6 sul lato controlaterale al soma MN5 (Fig. 1a). Questa architettura neuromuscolare è conservata in tutte le specie di insetti esaminate (locusta12, falena13, mosca carnaria14).
a, Registrazione rappresentativa di MN1–5 e frequenza del battito d'ali (traccia inferiore, ingrandita nella scatola nera) durante il volo vincolato. Schema codificato a colori di MN1–5 nel VNC e proiezioni assonali alle sei fibre del DLM. b, le frequenze medie di attivazione dei MN sono simili all'interno di ciascun animale. Il codice colore è lo stesso di a. n = 8 animali. I dati sono media ± sd c, la frequenza di sparo MN e la frequenza del battito d'ali (WB) (le barre rosse indicano i range di lavoro) sono linearmente correlate all'interno di un animale (punti grigi; coefficiente di correlazione, r2 = 0,63; P < 0,0001, t- test) e con una varianza maggiore anche tra gli animali (punti rossi; n = 100; coefficiente di correlazione, r2 = 0,31; P <0,0001, t-test a due code). d, Le risposte di attivazione dei MN (tracce superiori) alle iniezioni di corrente di diverse ampiezze (tracce inferiori). e, La frequenza media di risposta MN (f) e l'ampiezza della corrente iniettata (I) sono correlate approssimativamente linearmente per 2–30 Hz (n = 15 animali), superando quindi le normali frequenze di attivazione MN osservate durante il volo (riquadro; ~ 3–12 Hz, dati da c). I dati sono media ± sem (grafico principale) e mediana ± intervallo (riquadro). f, Durante il volo, i picchi MN1–4 sono dispersi nel tempo (in stato splay) con sequenze caratteristiche. Ogni animale passa da uno stato di apertura all'altro durante il volo, ma gli stessi stati di apertura sono preferiti tra gli individui (n = 8). I grafici a riquadri mostrano la mediana (linea centrale), i quartili (limiti dei riquadri) e l'intervallo (barre di errore). g, Tempistica dei picchi MN1–4 in quattro stati di apertura successivi (1423 (rosso); 1243 (turchese); 1234 (verde); 1324 (blu scuro)) durante il volo.
UAS-shakB-RNAi, middle) and overexpression of ShakB in MN1–5 (bottom). The black arrows mark MN4 and MN5 spikes, and the red arrows indicate simultaneous MN4–MN5 spikes. b, Phase histograms of the occurrence of MN5 spikes (y axis) in relation to consecutive MN4 spikes (phase φ = 0 corresponds to the MN4 spike) for control (top), shakB KD (middle) and ShakB overexpression (bottom) with a magnified view (inset) (n = 10 animals for each genotype). Data are mean (coloured bars) ± s.e.m. (grey). c, MN1–5 dye coupling in the dfmr1 RNAi KD background to increase dye uptake28. Scale bar, 20 μm. d–h, Intracellular recordings of MN pairs. d, Hyperpolarizations and depolarizations were conducted bidirectionally (from cell 1 to cell 2 and vice versa). e, Increasing current injection amplitude (top trace) increases response amplitudes in electrically coupled MNs (bottom trace). f, Plotting the mean presynaptic voltage (Vm) area against the mean postsynaptic voltage area (left) reveals linear relationships, but regression slopes differ between distinct MN pairs (5 animals with strong coupling between the MN1–MN2 and MN3–MN4 pairs; 10 animals with weak coupling between the MN1–MN3, MN1–MN4, MN2–MN3 and MN2–MN4 pairs). The mean CC (postsynaptic peak voltage divided by presynaptic peak voltage; right) differs significantly between MN1–MN2, MN3–MN4 (red, 6 pairs) and all other pairs (green, 10 pairs). Data are mean ± s.e.m. (left) and mean ± s.d. (right). g, RNAi KD of shakB eliminates detectable electrical coupling between MNs (3 animals). h, The CC for the spike AHP is higher than for the spike overshoot. i, Firing of a coupled MN ceases during the AHP of the presynaptic MN./p>0.21 yield network synchrony (splayness = 0; 200 simulations per CC, green dots; the black line shows the average). d, Quantification of 60 s simulations (green, 10 simulations per condition) with a weak CC (0.005) yields significantly lower MN4–MN5 synchronization indices (Methods; median = 0.54) compared with strong coupling (CC = 0.258; median = 1.0; two-sided Mann–Whitney U-test, P = 0.0002). Similarly, experimental (exp.; purple) synchronization indices are significantly lower in the controls (median = 0.56, 11 animals) compared with the ShakB-overexpression group (median = 0.84, 7 animals, P = 0.0008). e, Increasing Shab channel levels transforms the single-MN model dynamics from HOM near the SNL point through SNIC to Hopf types (Extended Data Fig. 9a), which vary in action potential waveform (top) and PRC (middle). Averaging theory (Methods and equation (4)) yields the odd part of the coupling function (bottom) for each phase distance ∆φ, of which the fixpoints (black dots) determine stable network states. Only the SNL type yields one stable fixpoint at phase 0.5, therefore favouring anti-phase firing. f–h, Shab overexpression in MN1–5 nearly doubles Shab current (f), which causes in-phase firing of the MN3–MN4 pair (g) and significantly (two-sided Mann–Whitney U-test, P = 0.0434) increased synchronization indices (median = 0.52, 10 animals) compared with the controls (median = 0.43, 8 animals) (h). Similarly, increasing Shab in models with weighted GJs (as in Fig. 3i) significantly increased MN3–MN4 synchronization (sync.) indices (median = 0.99, P = 0.0002). i,j, Network models with heterogenous CCs (i) as found in vivo (Fig. 2f) yield preferred splay states as in animals (j, right; 10 simulations per condition; 8 animals, the purple dots depict median values of in vivo data), whereas homogenous coupling does not (j, left). For the box plots in d, h and j, the median (centre line), quartiles (box limits) and range (whiskers) are shown./p>0.21, the network state is synchronized (Fig. 3c). To test these model predictions experimentally, we manipulated gap-junction strength genetically and quantified the synchrony of the MN4–MN5 pair from in vivo recordings during flight (Fig. 3d). In control animals with weak gap junctions, the synchronization index (Methods) is low, similar to model simulations with weak gap junctions. RNAi KD of electrical synapses increases synchronization in vivo (Fig. 3d), underscoring that gap junctions are required for desynchronization. Finally, the model predicts synchrony for strong electrical coupling. Indeed, strengthening of electrical coupling by ShakB overexpression significantly increases synchrony in vivo (Fig. 3d; see also Fig. 2b). Thus, weak electrical coupling is required for network desynchronization./p>5 GΩ; membrane potential of −70 mV was held with a holding current smaller than ±100 pA; series resistances of >15 MΩ were not accepted to ensure good control when applying current injections; only if these criteria were met for both MNs, the recordings were switched to current clamp mode. Resting membrane potential was around −60 mV without current injection. To determine coupling strength and rectification parameters of gap junctions between MNs, depolarizing and hyperpolarizing current was injected into one MN while the other was monitored simultaneously, and vice versa. Slow tonic firing was induced in one or both MNs at rates of between 3 and 8 Hz, as is observed during flight behaviour, by small somatic current injections while monitoring the respective other MN. For input–output relationships, firing was induced by 1,000 ms square pulse current injections up to 1 nA in 0.1 nA increments./p>2 electrically coupled neurons, this causes a frustrated state because antiphase locking at Δφ = 0.5 cannot be achieved for all units at the same time. In a small network, such as the MN1–5 network with its five coupled neurons, the splay state represents a low-frustration solution that determines the most likely network state60./p> 2. However, this is not observed in the CPG recordings (Fig. 1a). For the network to show frustration, pairs of neurons must be phase-repellent./p>3.0.CO;2-S" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291096-9861%2820000619%29422%3A1%3C1%3A%3AAID-CNE1%3E3.0.CO%3B2-S" aria-label="Article reference 13" data-doi="10.1002/(SICI)1096-9861(20000619)422:13.0.CO;2-S"Article CAS PubMed Google Scholar /p> P{UAS-GFP.VALIUM10}attP2), ShakB RNAi-kd (GMR23H06-ADZ attP49;GMR30A07-DBD attP2 > P{TRiP.HMC04895}attP2)). For the experimental data, a two-sided Pearson correlation determined a strong negative correlation (r = −0.94, p < 0.0001, n = 10). (e,f) Firing phase relationships between MN4 and MN5 in control animals (see also Fig. 2a,b, Extended Data Fig. 1) remain similar upon UAS-RNAi knockdown of receptors for inhibitory chemical synapses in MN1–5 (under the control of DLM-MN spilt-GAL4, GMR23H06-ADZ attP49; GMR30A07-DBD attP2), (e) the glutamate gated chloride channel (GluCl) and (f) Rdl GABA-ARs. GluCl-RNAi knockdown efficacy was confirmed by Western blotting and Rdl GABA-AR knockdown efficacy has previously been confirmed64. Coloured bars represent the average values from 10 animals for GluCl-RNAi, 8 animals for Rdl GABA-AR-RNAi, and grey bars the s.e.m./p>
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